5 Best Free Stacking logiciel de mise sous tension pour Windows Voici une liste de Best Free Focus Stacking Software pour Windows. Ces logiciels sont pratiques pour les photographes, en particulier lors de la post-traitement des photos Macro ou des photos microscopiques. Dans la quasi-totalité des logiciels mentionnés, le processus de mise au point des photos de pile est effectué en chargeant plusieurs images, puis en exécutant l'outil de pile. Ces logiciels détectent les parties les mieux focalisées des images, puis les combinent pour former une seule image. Tous les logiciels d'empilage de focus de mention ont GUI excepté un, qui est un outil d'empilage de ligne de commande d'empilage. Certains de ces logiciels également auto aligner les images si elles sont hors d'alignement, ce qui est beaucoup si vous n'avez pas un trépied pour cliquer sur des photos. Si vous avez déjà un ensemble de photos à empiler, puis continuez, donner le logiciel répertorié un essai. Ces logiciels effectuer diverses autres opérations ainsi, mais le point de mire de l'article a été maintenu sur l'empilage de mise au point des images. Alors que vous allez apprendre à connaître la mise en évidence de la liste focus freeware, vous saurez également comment faire Focus Stacking avec eux. L'empilage par mise au point est le processus d'empilement de plusieurs photos avec différentes zones ciblées, capturées à partir d'une seule position. Le logiciel d'empilement de focus répertorié dans cet article effectue le travail d'empilage de focus assez facilement avec des résultats satisfaisants. Mon logiciel préféré d'empilage de foyer: J'aime Picolay et TuFuse le plus comme outils libres d'empilement de foyer. Picolay vous permet de réaliser facilement l'empilement de photos même si vous avez plusieurs images à empiler, et elles sont hors d'alignement. TuFuse est un outil d'empilage de ligne de commande et permet d'obtenir une excellente sortie empilée. Je recommanderais TuFuse si vous avez parfaitement aligné images. Picolay est un logiciel incroyable d'empilage de foyer pour Windows. Il est léger et effectue le processus d'empilage très rapidement. Tout ce que vous avez à faire est d'ajouter un ensemble d'images différemment ciblées à ce logiciel, puis les empiler pour obtenir une sortie uniformément ciblée. Le processus d'empilement de focus fonctionne mieux pour les ensembles d'images Macro et Microscopique tournés à partir d'un point fixe. Si vous ne disposez pas d'une série d'images prêtes à l'empilage, vous pouvez consulter les astuces et astuces pour prendre des photos pour l'empilage de mise au point pour obtenir des images parfaites pour le processus. Si vos photos sont prêtes à être empilées, vous pouvez compter sur ce logiciel, même si vos photos ne sont pas alignées. La fonction d'alignement automatique fonctionne assez bien et peut être invoquée. En dehors de l'empilage de focus, vous pouvez également effectuer d'autres types d'empilage ici. Il s'agit de: Empilement basé sur la couleur, Moyenne d'images marquées, Réglage automatique de la luminosité, Définition de la balance des blancs, Ajout d'images de sous-traitance, Trame plate, Diviser par 1ère image. Etc. Comment faire la mise au point en utilisant Picolay: Une fois que vous ouvrez le logiciel, allez dans l'onglet Fichier pour ajouter des images. Sélectionnez et ajoutez un ensemble d'images que vous aimez pour focaliser la pile. Les images ajoutées sont affichées sous la forme d'une liste. Cliquez sur une image pour la prévisualiser. Maintenant allez à l'onglet Stack operations et cliquez sur Stack avec les paramètres actuels. Cela empile vos images en un rien de temps et affiche la sortie sur l'écran de prévisualisation de sortie. Si vous n'obtenez pas de résultat satisfaisant en raison de l'incompatibilité d'alignement, ou si la sortie a du bruit, vous pouvez modifier les paramètres d'empilage sous Stack. Gt Définir les paramètres d'empilage. Ici, vous pouvez définir Suppression du bruit, Filtre intelligent, Préférer cadre HighLow, Aligner les images, Améliorer automatiquement, et enregistrer la carte de profondeur. Une fois que vous obtenez une sortie souhaitée après l'empilage de la mise au point, vous pouvez enregistrer l'image de sortie du fichier gt Enregistrer le résultat comme dans les formats gif, png, jpg, png, bmp, tif, ico, emf ou wmf. L'ensemble des images que j'ai utilisé pour tester étaient hors d'alignement cependant, ce logiciel d'empilement de focus a pris soin de lui très bien. En dehors de l'empilement, vous pouvez également créer GIF à partir d'un ensemble d'images. Chargez les images et allez à l'onglet Image List pour créer GIF. Vous pouvez également créer des cartes de profondeur et des vues 3D à partir d'un ensemble d'images avec ce freeware. Ce logiciel est libre d'utiliser uniquement à des fins non commerciales. TuFuse est un logiciel d'empilement de ligne de commande gratuit stupéfiant. Il combine les parties les mieux ciblées de plans multiples et produit des images de sortie parfaitement focalisées. Non seulement la focalisation, elle combine également les parties assez exposées des images multiples. Ainsi, le résultat final est une combinaison des parties les mieux ciblées et exposées des images ajoutées. L'algorithme impliqué ici fonctionne assez bien et donne un résultat impressionnant à chaque fois. Il n'a pas d'interface graphique et vous devrez utiliser certains ensembles de commandes pour exécuter le processus d'empilage de focus. Si vous n'êtes pas vraiment à l'aise avec les opérations de ligne de commande, vous pouvez télécharger PTAssembler. Qui est un logiciel de couture d'image TuFuse vient avec elle et il sert d'interface graphique pour TFuse. Pour ceux qui sont à l'aise avec les opérations en ligne de commande, voici comment configurer les images de point en utilisant TuFuse en ligne de commande: Ouvrez le dossier de téléchargement où TuFuse est téléchargé, puis ouvrez le dossier TuFuse. Transférez les images à empiler dans ce dossier. Allez maintenant dans la barre d'adresse du dossier TuFuse, sélectionnez et supprimez le chemin du dossier, puis tapez CMD et appuyez sur Entrée. Cela ouvrira l'invite de commandes avec le répertoire TuFuse. Entrez la commande suivante pour mettre les images de la pile en focus: tufuse - o output. tif input1.tif input2.tif input3.tif input4.tif. Et appuyez sur Entrée. (Dans la commande ci-dessus, la sortie est le nom du fichier de sortie, et input1, input2 et input3 sont les noms de fichier d'entrée.) La sortie sera enregistrée dans le dossier TuFuse lui-même. La sortie sera toujours un fichier TIF, mais l'entrée peut être jpeg, png, bmp ou tif. Il y a différentes opérations liées à l'image que vous pouvez effectuer avec l'empilement focal, comme: manipulation de niveaux, ContrasteSaturation manipulation d'exposition, etc. Pour effectuer ces opérations, vous devez ajouter des codes spéciaux avec la ligne de code ci-dessus. La liste des codes peut être trouvée sur la page d'accueil de ce logiciel. Il s'agit d'un logiciel gratuit très facile à utiliser, qui produit des résultats exceptionnels d'empilage de photos. ImageJ (Stack Focuser Plugin) ImageJ est un logiciel de traitement d'images multiplateformes qui permet d'effectuer l'animation de focus gratuitement. Il s'agit d'un logiciel open source d'empilage qui fonctionne sur Java. La fonctionnalité pour empiler des photos ne vient pas inbuit mais est disponible en tant que plugin. La page Plugin de ce logiciel a une liste très vaste de plugins qui peuvent être utilisés pour manipuler des photos l'une d'elles est Stack Focuser. Téléchargez le plugin, copiez le fichier téléchargé et collez-le dans le dossier Plugins d'ImageJ. Maintenant, pour empiler des images, ouvrez le logiciel et chargez les images à empiler, un par un. Une fois que toutes les images sont ouvertes, cliquez sur le bouton Stk de la barre d'outils d'ImageJ, puis cliquez sur l'option Image to Stack. Cela convertit toutes les images ouvertes en une pile. Maintenant allez dans l'onglet Plugins, puis cliquez sur Stack Focuser. Une petite boîte de dialogue s'ouvre, cliquez sur OK. Votre pile d'images est traitée pour créer un nouveau focus de sortie empilée. Enregistrez l'image comme tif, gif, jpg, png, bmp. Etc Le temps global pris pour focaliser les images de pile, y compris le temps d'ajouter des plugins était très inférieur, et le processus a été exécuté très facilement. Vous pouvez découvrir un grand nombre de plugins pour manipuler des images à l'aide de ImageJ. CombineZP est un logiciel incroyable pour l'empilage d'images. L'interface de ce logiciel d'empilage de focus est assez lisse et facile à utiliser. Il suffit de charger les images que vous souhaitez empiler, puis de sélectionner l'option pour empiler des images. Avant de procéder à l'empilage, vous pouvez aligner les images chargées si les images ne sont pas alignées. Si vos images sont déjà alignées, sélectionnez l'option So Stack, puis cliquez sur Go. La sortie de la mise au point est stockée dans le dossier de sortie. Le dossier de sortie est créé là où le logiciel est stocké. L'image empilée était nette, sans aucune pièce détachée. Maintenant avec l'empilage de foyer, vous pouvez également effectuer divers autres types d'empilage d'image. La liste comprend: Soft Stack, Moyenne pondérée, Pyramid Weighted Average, Pyramid Stack et Pyramid Maximum Contraste. Vous pouvez également charger d'autres actions disponibles en tant que macros. Une fenêtre d'aide s'affiche lorsque vous démarrez ce logiciel. Cette fenêtre a différentes procédures et exemples pour vous enseigner comment fonctionne ce freeware. Chasy Draw IES Chasy Draw IES est un logiciel gratuit de traitement d'image pour éditer et manipuler des images. Il a une énorme liste d'outils, et l'un des outils vous aide à concentrer les photos de la pile sur PC. D'autres outils sont génériques et peuvent être trouvés sur la plupart des éditeurs d'image et des manipulateurs. Mettons l'accent sur l'outil d'empilement de focus. Tout ce que vous avez à faire est d'ouvrir les fichiers multiples à empiler sur ce logiciel. Une fois les images ouvertes, allez à Processes gt Stack. Mise au point. L'image traitée sera affichée sur l'espace de travail. Pour enregistrer l'image, allez dans FilegtSave. L'image empilée peut être sauvegardée dans les formats cd5, bmp, ani, gif, gtx, ico, jpg, jp2, pcx, png, tga et tiff. Avec l'empilage de la focalisation, il fournit également diverses autres options d'empilage d'image. Les informations suivantes sont une version mise à jour d'une méthode pour utiliser ImageJ pour analyser les transferts de western à partir d'une ancienne page maintenant obsolète. Si vous recherchez une option de workflow plus complète pour vos analyses par blot de western, consultez mon didacticiel sur l'utilisation d'Image Studio Lite. Un logiciel libre de LI-COR Biosciences. Le logiciel Image Studio Lite peut être téléchargé gratuitement à partir de licorislite. En plus de la fonctionnalité décrite ci-dessous pour ImageJ, Image Studio Lite fournit des fonctionnalités de gestion de données supplémentaires ainsi que des outils d'annotation pour produire des images prêtes à publier de vos westerns. ImageJ (rsb. info. nih. govijindex. html) peut être utilisé pour comparer la densité (aka l'intensité) des bandes sur un gélose ou un western blot. Ce tutoriel suppose que vous avez porté votre gel ou blot à travers l'étape de visualisation, de sorte que vous ayez une image numérique de votre gel en. tif. Jpg Png ou d'autres formats d'image (un. tif de 16 bits serait le format préféré pour conserver la quantité maximale d'informations dans l'image d'origine). Si vous numérisez un film radiographique sur un scanner à plat, assurez-vous d'utiliser un scanner capable de numériser des transparents (c'est-à-dire de film) et d'utiliser le logiciel du scanner pour enregistrer des images tiff de 16 bits. Voir les références à la fin de ce tutoriel pour une discussion sur les différentes façons que vous pouvez visser cette étape. Cela suppose également que vous n'avez pas surexposé votre image blot lorsque vous l'avez produite. Pour une explication des raisons pour lesquelles la surexposition ruine vos résultats, consultez cette page. La méthode décrite ici utilise la méthode d'analyse de gel décrite dans la documentation d'ImageJ: Gel Analysis. Vous préférerez peut-être l'utiliser plutôt que les méthodes décrites ci-dessous. Il devrait y avoir très peu de différence entre les résultats obtenus à partir des différentes méthodes. Cette version du didacticiel a été créée à l'aide d'ImageJ 1.42q sur une installation Windows 7 64 bits. 1. Ouvrez le fichier image en utilisant FilegtOpen dans ImageJ. 2. La routine d'analyse de gel exige que l'image soit une image à l'échelle des gris. La méthode la plus simple pour convertir en niveaux de gris est d'aller à ImagegtTypegt8-bit. Votre image devrait ressembler à la Figure 1. Figure 1. Une image fabriquée Western blot a ouvert dans ImageJ. L'information en haut de l'image indique que l'image est actuellement en mode 8 bits, en utilisant une LUT inversée (table de consultation). Le LUT inverseur garantit que les bandes foncées seront enregistrées en tant que valeurs de densité plus élevées. 3. Choisissez l'outil Sélections rectangulaires dans la barre d'outils ImageJ. Dessinez un rectangle autour de la première voie. ImageJ suppose que vos voies fonctionnent verticalement (donc les bandes individuelles sont horizontales), de sorte que votre rectangle doit être grand et étroit pour enfermer une seule voie. Si vous dessinez un rectangle court et large, ImageJ passera en supposant que les couloirs fonctionnent horizontalement (les bandes individuelles sont verticales), ce qui entraîne beaucoup de confusion. Figure 2. La première voie a été sélectionnée avec l'outil Rectangular Selections 4. Après avoir dessiné le rectangle sur votre première voie, appuyez sur la touche 1 (Commande 1 sur Mac) ou sur AnalyzegtGelsgtSelect First Lane pour Rectangle en place. La première voie sera maintenant mise en surbrillance et comportera un 1 au milieu. 5. Utilisez votre souris pour cliquer et tenir au milieu du rectangle sur la première voie et le faire glisser sur la voie suivante. Vous pouvez également utiliser les touches fléchées pour déplacer le rectangle, bien que cela soit plus lent. Centrez le rectangle sur la gauche de gauche à droite, mais don8217t s'inquiètent de la doublure il parfaitement sur le même axe vertical. Image-J alignera automatiquement le rectangle sur le même axe vertical que le 1er rectangle à l'étape suivante. 6. Appuyez sur 2 (Commande 2 sur Mac) ou sélectionnez AnalyzegtGelsgtSelect Next Lane pour placer le rectangle en place sur la 2ème voie. Un 2 apparaît dans la voie lorsque le rectangle est placé. 7. Répétez les étapes 5 à 6 pour chaque voie suivante sur le gel, en appuyant sur 2 (Commande 2 sur Mac) à chaque fois pour mettre le rectangle en place (Figure 3). Figure 3. Placez le rectangle sur chaque voie, en appuyant sur 2 à chaque fois pour mettre le rectangle en place. 8. Après avoir placé le rectangle en place sur la dernière voie (en appuyant sur 2), appuyez sur 3 (Commande 3 sur Mac) ou allez dans AnalyzegtGelsgtPlot Lanes pour dessiner un tracé de profil de chaque voie. Figure 4. Le tracé de profil à partir de l'empreinte de Western d'exemple. 9. La courbe de profil représente la densité relative du contenu du rectangle sur chaque couloir. Les rectangles sont disposés de haut en bas sur le tracé du profil. Dans l'exemple d'image par transfert Western, les pics dans le graphique de profil (figure 4) correspondent aux bandes foncées dans l'image originale (figure 3). Parce qu'il y avait quatre voies sélectionnées, il y a quatre sections dans le tracé du profil. Les pics supérieurs représentent des bandes plus sombres. Les pics plus larges représentent des bandes qui couvrent une gamme de taille plus large sur le gel d'origine. 10. Les images de gels réels ou de western blots auront toujours un certain signal de fond, de sorte que les pics atteignent la ligne de base du profil. La figure 5 montre un pic à partir d'un buvard réel où il y avait un bruit de fond, de sorte que le pic semble flotter au-dessus de la ligne de base du graphique de profil. Il faudra fermer le pic pour pouvoir mesurer sa taille. Figure 5. Les transferts western réels ont souvent un bruit de fond, de sorte que le pic n'atteint pas la ligne de base (blanc parfait). 11. Sélectionnez l'outil de sélection Ligne droite dans la barre d'outils ImageJ (Figure 6). Pour chaque pic que vous voulez analyser dans le graphique de profil, tracer une ligne à travers la base du pic pour enfermer le pic (Figure 5). Cette étape nécessite un jugement subjectif de votre part pour décider où le pic se termine et le bruit de fond commence. Figure 6. Utilisez l'outil en ligne droite pour fermer la base de chaque pic d'intérêt. Figure 7. Le pic de la figure 5 est représenté avec une ligne tracée à travers la base du pic pour enfermer la zone du pic. 12. Notez que si vous avez plusieurs pistes en surbrillance, les dernières pistes seront masquées au bas de la fenêtre du tracé de profil. Pour voir ces pistes, appuyez et maintenez la barre d'espace, et utilisez la souris pour cliquer et faire glisser le tracé du profil vers le haut. 13. Lorsque chaque sommet a été fermé à la base avec l'outil de sélection Straight Line, sélectionnez l'outil Wand de la barre d'outils ImageJ (Figure 8). Figure 8. Choisissez l'outil Baguette pour mettre en surbrillance chaque pic d'intérêt sur le tracé du profil. 14. À l'aide de la barre d'espace et de la souris, faites glisser le graphique de profil vers le bas jusqu'à ce que vous reveniez à la première voie. Avec l'outil Baguette, cliquez à l'intérieur du pic (Figure 9). Répétez cette opération pour chaque pic lorsque vous descendez dans le graphique du profil. Pour chaque pic que vous mettez en surbrillance, les mesures doivent apparaître dans la fenêtre Résultats qui s'affiche. Figure 9. Cliquez à l'intérieur du 1er pic d'intérêt avec l'outil Baguette. Le pic doit être mis en surbrillance et une mesure doit apparaître dans la fenêtre Résultats. 15. Lorsque tous les pics ont été mis en évidence, allez à AnalyzegtGelsgtLabel Peaks. Cela marque chaque pic par sa taille, exprimée en pourcentage de la taille totale de tous les pics en surbrillance. 16. Les valeurs de la fenêtre Résultats (Figure 10) peuvent être déplacées vers un tableur en sélectionnant EditgtCopy All dans la fenêtre Résultats. Collez les valeurs dans une feuille de calcul. Figure 10. La sortie de la sélection des pics dans le tracé du profil et l'étiquetage des pics. Dans ce cas, les résultats proviennent de la sélection de la bande supérieure dans chacune des 4 voies dans l'exemple de western blot de la figure 1. Remarque: Si vous cliquez accidentellement au mauvais endroit avec la baguette. Le programme enregistre toujours la zone cliquée comme un pic et il factorise dans la zone totale utilisée pour calculer les valeurs de pourcentage. Évidemment, cela faussera vos résultats si vous cliquez dans les zones qui aren8217t pics. Si vous ne cliquez pas au bon endroit, passez à AnalyzegtGelgtLabel Peaks pour tracer les résultats actuels, qui affiche les valeurs incorrectes, mais surtout redéfinit le compteur de la fenêtre Résultats. Revenez à l'intrigue du profil et commencez à cliquer à nouveau à l'intérieur des sommets, en commençant par le premier pic d'intérêt. La fenêtre Résultats doit effacer et commencer à afficher vos nouvelles valeurs. Lorsque vous êtes sûr de cliquer sur tous les pics corrects sans cliquer accidentellement dans les zones incorrectes, vous pouvez revenir à AnalyzegtGelsgtLabel Peaks et obtenir les bons résultats. Analyse des données Avec vos données collées dans une feuille de calcul, vous pouvez maintenant calculer la densité relative des pics. Pour rappel, les valeurs calculées par ImageJ sont des nombres essentiellement arbitraires, ils n'ont de sens que dans le contexte de l'ensemble des pics que vous avez sélectionnés sur l'image de gel unique que vous avez travaillé. Ils n'ont pas d'unités de g de protéines ou d'autres unités du monde réel que vous pouvez penser. La procédure normale consiste à exprimer la densité des bandes sélectionnées par rapport à une bande standard que vous avez également sélectionnée au cours de ce processus. 1. Placez vos données dans une feuille de calcul. Un des sommets devrait être votre norme. Dans cet exemple, nous utiliserons le 1er pic comme norme. 2. Dans une nouvelle colonne à côté de la colonne Pourcentage, divisez la valeur Pourcentage pour chaque échantillon par la valeur Pourcentage de la norme (le 1er pic dans ce cas, 26.666). 3. La colonne de valeurs résultante est une mesure de la densité relative de chaque pic, par rapport à la norme, qui aura évidemment une densité relative de 1. Figure 11. Calcul de la densité relative pour chacun des 4 pics en surbrillance. Nous utilisons l'échantillon 1 comme standard pour ce gel. La densité relative est calculée en divisant la valeur en pourcentage de chaque échantillon par la valeur en pourcentage de la norme. 4. Dans cet exemple, la 2e voie a une Densité relative plus élevée (1,86), ce qui correspond bien à la taille et à l'obscurité de cette bande dans l'image originale (Figure 1). Rappelons que ces données sont pour la rangée supérieure de bandes sur l'image de western blot originale. 5. Si vous voulez comparer la densité d'échantillons sur de multiples gels ou blots, vous devrez utiliser le même échantillon standard sur chaque gel pour fournir une référence commune lorsque vous calculez les valeurs de densité relative. Voir les sections ci-dessous pour une analyse plus détaillée de ces exigences. 6. Afin de tester les différences significatives entre les traitements dans une expérience, tous vos gels ou blots devront être numérisés et quantifiés en utilisant cette méthode, et les valeurs seront exprimées en termes de densité relative, ou vous pouvez traiter la densité relative Comme une valeur de changement de pli (c'est-à-dire une différence de densité relative de 2 entre un témoin et un traitement indiquerait un changement de 2 fois dans l'expression). Si vous utilisez des techniques d'analyse de variance pour tester vos données, vous devrez peut-être vous assurer que vos valeurs de densité relative sont normalement distribuées et qu'il y a homogénéité de variance entre les différents traitements. 7. Il convient de noter ici que certains chercheurs font l'effort supplémentaire d'inclure un ensemble de dilutions en série d'une norme connue sur chaque tache. En utilisant la courbe de dilution en série et les techniques de quantification décrites ci-dessus, il devrait être possible d'exprimer vos bandes d'échantillons en termes de picogrammes ou nanogrammes de protéines. Un exemple plus impliqué utilisant des contrôles de chargement. We8217ll utilisent la figure 12 comme un western blot représentatif. Sur cette tache, nous prétendons que nous avons chargé quatre échantillons répétés de protéines (quatre charges de pipette dans le même flacon d'homogénat), donc nous nous attendons à ce que les densités dans chaque voie soient équivalentes. La rangée supérieure de barres représentera notre protéine d'intérêt. L'ensemble inférieur de barres représentera notre protéine de contrôle de chargement, qui est censé assurer qu'une quantité égale de protéine totale était chargée dans chaque voie. Cette protéine de contrôle de chargement est une protéine qui est vraisemblablement exprimée à un niveau constant indépendamment du traitement appliqué aux organismes originaux, comme l'actine (bien que beaucoup de gens remettent en question l'affirmation selon laquelle l'actine sera exprimée de manière équivalente dans les traitements). Figure 12. Un western blot d'exemple avec une rangée inférieure de bandes de contrôle de chargement. Souvent, ces bandes représentent une protéine qui est pensée pour être exprimée de manière équivalente dans tous les traitements, tels que l'actine. En regardant la Figure 12, nous avions espéré charger des quantités équivalentes de protéines totales dans chaque couloir, mais après avoir exécuté le Western blot, la taille et l'intensité des barres inférieures de chaque couloir varient beaucoup. Les deux voies de gauche semblent équivalentes, mais la 3e voie a la moitié de la densité (valeur de gris) par rapport aux voies 12, tandis que la voie 4 a la moitié de la densité et la moitié de la taille par rapport aux voies 12. Comme nos contrôles de chargement sont si différents, Les valeurs de l'ensemble supérieur des bandes peuvent ne pas être directement comparables. Nous utilisons la routine d'analyse de gel ImageJ8217s pour quantifier la densité et la taille des blots et utiliser les résultats de nos contrôles de chargement (bandes inférieures) pour mettre à l'échelle les valeurs de notre protéine d'intérêt (bandes supérieures). 1. Ouvrez l'image de western blot dans ImageJ. 2. Assurez-vous que l'image est en mode 8 bits: allez à ImagegtTypegt8-bit. 3. Utilisez l'outil rectangle pour dessiner une zone autour de la première voie (les deux barres supérieures et inférieures sont incluses.) 4. Appuyez sur 822018221 (ou sur la commande 1 sur Mac) pour définir le rectangle. Un 822018221 devrait apparaître au milieu du rectangle. 5. Appuyez sur 822028221 (Commande 2 sur Mac) pour définir le rectangle de la voie 2. Un 822028221 doit apparaître au milieu du rectangle. Répétez les étapes 5 à 6 pour chaque voie suivante, en appuyant sur 822028221 (Commande 2 sur Mac) pour définir le rectangle sur chaque voie suivante (voir Figure 13) Figure 13. Chaque voie a été sélectionnée en déplaçant le rectangle au-dessus et en appuyant sur 822028221 pour régler Le rectangle en place 8. Lorsque vous avez placé la dernière voie (et appuyé sur 822028221 pour la mettre en place), vous pouvez appuyer sur 822038221 pour produire un tracé des voies sélectionnées (voir Figure 14). (Avec la voie 1 en haut, la voie 4 en bas). Vous devrez peut-être faire défiler la fenêtre pour voir toutes les voies. 9. Le tracé de profil représente essentiellement la valeur de densité moyenne à travers un ensemble de tranches horizontales de chaque couloir. Les taches plus foncées auront des pics plus élevés, et les taches qui couvrent une plage de taille plus grande (kD) auront des pics plus larges. Dans notre exemple de western blot, les bandes sont des rectangles parfaits, mais vous remarquerez une certaine pente dans les pics de tracé de profil, comme ImageJ est l'application d'un peu de la moyenne des valeurs de densité comme il se déplace de haut en bas de chaque voie. En conséquence, la transition brusque entre le blanc parfait et le noir parfait sur les bandes de la piste 1 se traduit par une légère pente sur le graphique du profil en raison de la moyenne. 10. Sur notre western blot idéalisé utilisé ici, il n'y a pas de bruit de fond, donc le pic atteint tout le chemin jusqu'à la ligne de base de la parcelle de profil. Dans les transferts western réels, il y aura un bruit de fond (l'arrière-plan ne sera pas parfaitement blanc), de sorte que les pics atteindront la ligne de base du profil (voir figure 5 ci-dessus). Par conséquent, chaque parcelle devra avoir une ligne tracée à travers la base du pic pour la fermer. 11. Sélectionnez l'outil de sélection Ligne droite dans la barre d'outils ImageJ. Pour chaque pic que vous voulez analyser dans le tracé du profil, tracer une ligne à travers la base du pic pour entourer le pic (Figure 7). Cette étape nécessite un jugement subjectif de votre part pour décider où le pic se termine et le bruit de fond commence. 12. Lorsque chaque pic d'intérêt est fermé avec l'outil à ligne droite, passez à l'outil Baguette. Nous utiliserons l'outil baguette pour mettre en évidence chaque pic d'intérêt afin que Image-J puisse calculer son areadensité relative. 13. Nous commencerons par mettre en évidence les bandes de contrôle de chargement (rangée inférieure) sur notre western blot. En commençant par le haut du tracé du profil, utilisez la baguette pour cliquer à l'intérieur du 1er pic (Figure 15). Le pic doit être mis en surbrillance après avoir cliqué dessus. Continuez à cliquer sur les pics de chargement pour les autres voies. Si une voie n'est pas visible en bas du graphique de profil, maintenez la barre d'espace enfoncée et cliquez-et-faites glisser le tracé de profil vers le haut pour révéler les voies restantes. Figure 15. Cliquez à l'intérieur du pic de chargement-contrôle avec l'outil baguette. Cliquez sur chacun des pics de contrôle de chargement pour les voies restantes (ignorez les voies protéiques à gauche pour l'instant). 14. Lorsque le pic de contrôle de chargement pour chaque voie a été mis en surbrillance avec la baguette, allez à AnalyzegtGelgtLabel Peaks. Chaque pic en surbrillance sera étiqueté avec sa taille relative exprimée en pourcentage de la superficie totale de tous les pics en surbrillance. Vous pouvez aller dans la fenêtre Résultats et choisir EditgtCopy All pour copier les résultats pour le placement dans une feuille de calcul. Figure 16. Valeurs de surface et de pourcentage de nos bandes de contrôle de chargement à partir de l'empreinte de western d'exemple. Les bandes 1 et 2 sont égales, comme on peut s'y attendre en regardant les bandes d'origine sur le Western blot (figure 12). 15. Répétez les étapes 13 à 14 pour les pics d'échantillonnage réels maintenant. Nous sélectionnons ces pics séparément des pics de contrôle de chargement afin que ces zones ne soient pas prises en compte dans le calcul de la densité de nos protéines d'intérêt. Comme précédemment, utilisez l'outil Baguette pour cliquer à l'intérieur de la zone du pic dans la première voie, puis continuez à cliquer à l'intérieur des pics des voies restantes. Lorsque vous avez terminé, allez à AnalyzegtGelgtLabel Peaks pour afficher les résultats. Copiez les résultats dans une feuille de calcul à côté des données pour les bandes de contrôle de chargement (Figure 17). Figure 17. Résultats des bandes de contrôle de chargement (marquées 8220stds8221 ici) et les pics de protéine d'échantillon (la rangée supérieure de bandes sur le Western blot original). Analyse des données avec des bandes de contrôle de chargement 1. Avec toutes les valeurs de densité relative maintenant dans la feuille de calcul, nous pouvons calculer les quantités relatives de protéines sur le transfert de Western. Rappelez-vous que les valeurs 8220Area8221 et 8220Percent8221 retournées par ImageJ sont exprimées en valeurs relatives, en fonction uniquement des pics que vous avez mis en surbrillance sur le gel. Commencez l'analyse en calculant les valeurs de densité relative pour chacune des bandes standard de chargement. Dans ce cas, nous allons prétendre que Lane 1 est notre contrôle que nous voulons comparer les 3 autres voies. Divisez la valeur de pourcentage pour chaque voie par la valeur de pourcentage dans le contrôle (piste 1 ici) pour obtenir un ensemble de valeurs de densité qui est relatif à la quantité de protéine dans la bande de chargement-commande de Lane 18217s (figure 18). Figure 18. Calculez les valeurs de densité relative en divisant les valeurs de Pourcentage dans chaque rangée par l'échantillon témoin. 8217s Pourcentage de valeur (Lane 1, 40.828, dans notre exemple). 2. Ensuite, nous calculons les valeurs de Densité Relative pour nos bandes de protéines d'échantillon (rangée supérieure sur l'empreinte de western d'exemple). Nous effectuons un calcul similaire à celui de l'étape 1, en divisant la valeur en pourcentage de chaque ligne par la valeur en pourcentage de notre bande de protéine de contrôle 8217 (ligne 1 ici). Figure 19. Calculez également les valeurs de densité relative pour les échantillons, en utilisant la valeur de pourcentage pour votre bande de protéine témoin (Voie 1, 40.585 ici). Note: Rappelez-vous que parce que certaines de nos bandes de contrôle de chargement étaient sauvagement différentes sur le Western blot original, nous pouvons simplement utiliser les valeurs de densité relative de nos échantillons calculés à l'étape 2 comme résultats finaux. Maintenant, il est nécessaire d'escalader les valeurs de densité relative pour les échantillons par la densité relative des bandes de contrôle de chargement correspondantes pour chaque voie. Nous faisons ceci en partant de l'hypothèse que les différences proportionnelles dans les densités relatives des bandes de contrôle de charge représentent les différences proportionnelles dans les quantités de protéines totales que nous avons chargées sur le gel. Dans notre exemple de western blot, nous avons des preuves de quantités massivement différentes de protéines totales dans chaque échantillon (mauvaise pratique de pipettage, probablement). 3. L'étape finale consiste à dimensionner nos Densités relatives d'échantillon en utilisant les densités relatives des contrôles de chargement. Sur la feuille de calcul, divisez la Densité relative d'échantillon de chaque voie par la Densité relative de contrôle de chargement pour cette même voie. Figure 20. Les valeurs de densité ajustées (cellules jaunes) pour nos échantillons ont été calculées en divisant la densité relative de chaque voie d'échantillonnage par la densité relative du contrôle de chargement pour la même voie. Par exemple, la densité relative de l'échantillon 4 (0,1628) a été divisée par la densité relative pour le contrôle de chargement dans la voie 4 (0,154379) pour obtenir une valeur de densité ajustée de 1,054. 4. Lorsque nous avons créé notre exemple imaginaire de western blot, nous nous attendions à obtenir des quantités équivalentes de la protéine d'intérêt dans chaque voie, car nous avons (hypothétiquement) chargé des volumes d'échantillons équivalents de protéines à partir du même flacon d'homogénat dans chaque voie. Au cours du processus de chargement, quelque chose a mal tourné, et nous avons obtenu des densités très différentes sur le western blot. Mais après avoir effectué les corrections de contrôle de chargement ci-dessus, nous constatons que nos densités ajustées pour chacune des 4 voies sont approximativement équivalentes (toutes sont approximativement 1), ce qui indique qu'il ya des rapports équivalents de la protéine d'intérêt contenue dans l'échantillon du total Protéine dans chaque voie, comme on peut s'y attendre. L'exemple ci-dessus représente un cas particulier. En réalité, vous serez généralement assez habile pour pipeter des quantités équivalentes de protéines totales dans vos voies de gel, probablement parce que vous avez utilisé un processus comme le BCA Protein Assay pour quantifier la quantité totale de protéine présente dans chacun de vos échantillons homogénéisés. Cela permet d'éviter le besoin de bandes de contrôle de chargement et la controverse associée sur le fait que la protéine utilisée pour évaluer le chargement égal est véritablement exprimée de façon uniforme dans tous les niveaux de traitement. Si vous pouvez appliquer des quantités égales de protéines totales à chaque voie d'un gel, alors vous devez vous préoccuper d'avoir un échantillon standard approprié placé sur chaque western blot que vous exécutez pour le projet. Par exemple, vous pouvez acheter une aliquote de Hsp70 humaine purifiée et placer 1l dans une voie sur chaque gel que vous exécutez en sondant pour Hsp70. Ou vous pourriez économiser de l'argent en créant votre propre échantillon standard en mélangeant des aliquotes de plusieurs de vos homogénats pour faire une grande quantité d'homogénéisation mixte que vous pouvez utiliser pour charger un volume standard sur une seule voie de chaque gel pour votre projet entier (en cours d'exécution Hors de ce mélange à travers votre projet serait une mauvaise chose). In this case you may not know the true concentration of the protein of interest in your mixed homogenate, but you will at least be able to get an equivalent amount of total protein (including the protein of interest) on each gel. The goal of the standard sample is to account for variations in antibody binding efficiency (for example if you8217re re-using a mixture of antibody on multiple western blots to save money), for variations in blocking and washing efficiency, for variation in the decay rate of a chemiluminescent reagent used to visualize the antibodies, or for variation in the exposure time of your x-ray film. In any of these cases, the intensity of the signal you get out of your western blot can vary from blot to blot (Figure 21). You can use a standard sample on each gel to normalize every other band on that same blot, and then compare across multiple blots because every band in your dataset is normalized to the same standard (be it 10ng of Human Hsp70 or a mixture of several homogenates). Figure 21. Two example western blots with a common standard sample (Lane 1). The bindingincubationdevelopment steps of these two blots varied slightly, resulting in a different final exposure which alters the absolute densities on the two blots. Because we have a standard sample on both blots, which is an identical volume of an identical protein sample (i. e. drawn from a common aliquot of homogenate), we can express the densities of the other lanes on each gel relative to the standard sample, eliminating the effects of the differing exposures. Finally, if you are using a loading-control protein band (lower row on these blots) on each gel, and a standard protein sample on multiple gels, you can correct both for differences in total protein loaded in a lane (using the loading-control band) and for differences in exposure between gels (using the standard sample). For example, consider the two gels in Figure 21. The 1st (white) gel has minimal background noise, and there is some variation the amount of protein loaded in each lane, as revealed by the size and density of the loading control bands of the samples. The 1st lane on the left is our standard sample used on each gel. The 2nd (gray) gel has more background noise due to a different exposure time, poor washing, or any number of possible problems. Again, there are different protein quantities loaded in the 4 lanes, based on the size and density of the loading-control bands on the lower half. The 1st lane on the left is the same standard protein sample as that used on the 1st gel. We would start by analyzing the two gels separately, using the protocol in the loading-control portion of this document. 1. Calculate the relative density of the loading-control bands (lower row on this gel). Use the loading-control band for the standard in lane 1 to do this calculation. 2. Calculate the relative density of the bands for the protein band of interest (upper row on this gel). Use the protein band of interest for the standard in lane 1 to do this calculation. 3. Adjust the relative densities calculated in Step 2 using the relative densities for the loading-control bands calculated in Step 1. Simply divide the relative density from Step 2 for each lane by the corresponding relative density from Step 1. After you8217ve scaled the density of the protein of interest for each sample to the standard sample, and adjusted the relative density based on the loading-control band, you are left with an estimate of the relative density of the protein of interest in each lane on your gel (relative to the standard in lane 1). Repeat this for each separate gel. When finished, you8217ll note that because every sample lane is normalized to the standard sample in Lane 1 on that particular gel, and every gel contains the same standard sample, your cross-gel comparison is already accomplished, since every sample is now normalized to the same standard sample (Figure 22). Figure 22. Example data from two western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The 8220Adjusted Density8221 for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i. e. for sample 3, 0.1857960.188449 0.98592). After all of this work, you8217re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 36) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 14 and 25) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls8217 average value as a baseline. A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring. Figure 25. A comparison of 8220area8221 values returned by ImageJ. In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake 8220bands8221 in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value darker band). Additionally, I have included the 8220area8221 value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these 8220area8221 values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 12), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 15), the value reported by Image-J is halved. Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape. The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 13) yields an equivalent value from ImageJ. Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the 8220area8221 values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed. Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 13, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i. e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same 8220area8221 value for both of these lanes. It is worth reiterating that the 8220area8221 values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above (Figure 27), the band in column 1 returns an 8220area8221 value of 4000, while in the previous two images column 1 (Figs 25 26) had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you8217ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels. Additional references 8211 The methods outlined here are by no means canonical and there are plenty of subtleties to be considered in this sort of analysis. For more practical considerations of scanning and analyzing gel images, see the following papers: Gassmann, M. Grenacher, B. Rohde, B. and Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855. doi: Tan, H. Y. and Ng, T. W. (2008). Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Optics Communications 281, 3013-3017. doi: You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. Both comments and pings are currently closed.
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